NK-клетки - это специфический тип клеток иммунной системы. Одни относятся к числу лимфоцитов, другие рассматриваются как отдельная субпопуляция клеток иммунной системы.

Некоторые NK-клетки обладают уникальной способностью спонтанного убийства целевых клеток, без предварительной иммунизации. Чем отличаются от других лимфоцитов, которым чтобы разрушить целевую клетку требуется стимуляции в виде взаимодействия с другими клетками иммунной системы.

Кроме того, работа НК-клеток происходит независимо от ограничений системы тканевой совместимости, что также является их уникальной особенностью. От этих исключительных свойств НК-клеток, происходит их название, которое по-английски звучит «natural killers», то есть «естественный убийца».

Характеристика NK-клеток

NK-клетки обнаружены были в начале семидесятых годов XX века. Установлено то, что возможность спонтанного уничтожения возникших раковых клеток клетками NK является физиологическим явлением у здоровых людей.

Эта функция NK-клеток, называемая «естественная цитотоксическая противоопухолевая активность», заключающаяся в обнаружении и уничтожении в зародыше вновь возникших раковых клеток, защищает от развития рака .

Мало того, было обнаружено, что у людей с развитым раком, активность НК-клеток значительно меньше, чем у здоровых людей. Таким образом, низкая активность НК-клеток в крови связана с высоким риском заболеть в будущем раком.

Помимо участия в антираковом сопротивлении, NK-клетки играют большую роль в борьбе с инфекцией , в основном, борются с вирусными возбудителями. Об этом свидетельствует факт их высокой активности во время вирусных инфекций , особенно в пределах органа, пораженного инфекцией.

Вирусы, попадая в организм, проникают внутрь клеток, что как бы прячутся от клеток иммунной системы, становясь для них менее доступны. Именно такие, зараженные вирусами клетки, которые другие виды лимфоцитов не в состоянии распознать и ликвидировать, становятся мишенью для имеющих способность естественной цитотоксичности NK-клеток.

Кроме перечисленных выше функций клеток-киллеров, их высокая активность отмечается также в слизистой оболочке матки во второй половине менструального цикла, т.е. после овуляции, а также в начальный период беременности.

В последнем случае, NK-клетки составляют до 70% лимфоцитов, находящихся в пределах слизистой оболочки беременной матки. Их роль не до конца изучена, но предполагается, что они участвуют в контроле развития начального периода беременности и защищают клетки плода от заражения вирусами .

Лабораторные стандарты NK-клеток в крови

NK-клетки составляют несколько процентов лимфоцитов периферической крови человека. Количество NK-клеток составляет около 0,37 г/л. Контрольные нормы находятся в пределах 0,09-0,43 Г/л.

Активность NK-клеток исследуется в цитотоксических тестах, длительностью примерно 4-6 часов. У человека активность NK-клеток определяется, как правило, на лейкемической линии K562.

Из всего множества клеток, которые «курсируют» в наших телах, около 2 миллиардов, что равно примерно 5-15% от общего числа клеток, являются натуральными клетками киллерами (NK-клетками). Название звучит угрожающе, но опасны они только для раковых клеток и других патогенов, которые вредят организму.

Натуральные клетки киллеры являются критически важным компонентом иммунной системы любого человека, особенно если он борется с раком, поэтому поддержание достаточного уровня NK-клеток в организме крайне важно.

ЧТО ТАКОЕ НАТУРАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ КИЛЛЕРЫ

Натуральные клетки киллеры представляют собой лимфоциты или белые кровяные тельца, которые являются частью лимфатической системы. NK-клетки заняты важной работой – они «патрулируют» кровоток, чтобы защищать его от разного рода «захватчиков» и раковых клеток. Формируются они в костном мозге, лимфатических узлах, миндалинах, тимусе, селезенке, а также могут быть обнаружены в печени, кишечнике, коже и легких.

Прямо в данный момент в вашем организме могут развиваться злокачественные клетки (которые есть у абсолютно всех людей). Но если в вашем организме много сильных NK-клеток, то вам нечего опасаться. В соответствии с исследованием, опубликованным в журнале Biomed Biotechnology в 2011 году, эти клетки имеют способность контролировать как рост опухоли, так и метастаз . Метастазированием называется распространение раковых клеток из одной части тела в другую, обычно через лимфатическую систему и кровь.

Натуральные клетки киллеры блокируют рост и распространение рака посредством своей способности напрямую вызывать клеточную цитотоксичность и смерть раковых клеток .

КАК ОНИ ДЕЙСТВУЮТ

• Натуральные клетки киллеры «патрулируют» кровоток и отыскивают вирусы, бактерии и раковые клетки.
• При обнаружении «посторонних захватчиков» группа NK-клеток впрыскивает токсичное вещество в непосредственно нездоровую клетку.
• Токсичное вещество проникают в раковую клетку или в клетку вируса и уничтожает ее.
• Затем KN-клетки высвобождают гормон, который призывает другие клетки иммунной системы, чтобы они уничтожили остатки злокачественной клетки или клетки «захватчика».

Каким образом натуральные клетки киллеры понимают является ли клетка здоровой или злокачественной? Ученые все еще изучают, каким образом натуральные клетки киллеры распознают мутировавшую клетку. На сегодняшний день известно, что натуральные клетки киллеры обладают встроенной системой «обнаружения и связи», которая связывается с ядром подозрительной клетки для выяснения того, является ли она здоровой или нет. На основе полученной информации, они принимают решение атаковать эту клетку или нет. Ядро – это центр управления каждой клеткой в организме, включая злокачественные, оно содержит ДНК и контролирует производство клетками генов и белков.

ЧТО ПРЕДПРИНЯТЬ, ЧТОБЫ НАТУРАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ КИЛЛЕРЫ В ВАШЕМ ОРГАНИЗМЕ БЫЛИ ЗДОРОВЫМИ И СИЛЬНЫМИ

1. Сохраняйте свой кишечник в здоровом состоянии

От 65-70% иммунной системы находится в вашем кишечнике, включая значительное количество натуральных клеток киллеров. Для правильного функционирования иммунной системы и эффективной работы NK-клеток, необходимо поддерживать флору кишечника в сбалансированном состоянии.

Избегайте сахара и сладкого, полуфабрикатов, мучных продуктов, ежедневно употребляйте пробиотики и пребиотики. Ферментированные продукты могут повысить работу иммунной системы, а также устранить или предотвратить состояния, которые приводят к синдрому протекающего кишечника.

Считается, что кишечные расстройства, в частности синдром протекающего кишечника, приводят к аутоиммунным заболеваниям. Университет Вашингтона провел исследование в 2013 году, в котором четко обозначил связь между аутоиммунными заболеваниями и нарушениями в производстве NK-клеток, а также низкой функциональностью этих клеток.

1. Снижайте количество токсинов в организме

Иммунное старение – это общее снижение работы иммунной системы. Отчасти снижение возрастной иммунной системы, вероятно, связано с меньшей эффективностью и снижением производства NK-клеток.

Прежде всего, помните, что . Умейте бороться со стрессами в своей жизни и снижать их воздействие на ваш организм. Реакция вашего организма на стресс и тот обвал гормональной системы, которую он вызывает, напрямую связаны с понижением работы иммунной системы.

Гуляйте ежедневно на природе, занимайтесь спортом, молитесь, занимайтесь пилатесом, растяжкой для снижения стрессов, общайтесь с друзьями, занимайтесь любимым хобби.

Помните, что вы подвергаете свое тело токсинам, когда принимаете в пищу полуфабрикаты, неорганические фрукты и овощи, когда пломбируете каналы в кабинете стоматолога, когда ставите или не удаляете уже существующие амальгамовые пломбы (серебряные), когда пользуетесь декоративной косметикой и косметикой для тела, бытовой химией, живете рядом с вышками сотовой связи и так далее. Тщательно отбирайте продукты, которые вы употребляете в пищу, и особенно продукты, которые вы наносите на тело, ищите только продукты органического производства из натуральных продуктов!

Обязательно устраивайте детокс для тела – это могут быть , инфракрасная сауна, . Все эти меры помогут снять стресс, удалить из тела токсичные отходы и накопления, усилить работу иммунной системы.

1. Поднимайте уровень мелатонина в организме посредством качественного сна

Мелатонин — гормон, который вырабатывается шишковидной железой, и сам по себе является мощным средством, которое тормозит развитие рака в организме, особенно в случае рака молочной железы. Согласно исследованиям, мелатонин практически заставляет злокачественные клетки замедлять свою работу и рост. Бразильское исследование 2016 года, опубликованное в рецензируемом журнале Plos One, говорит о том, что мелатонин также оказывает влияние на стволовые раковые клетки.

1. Ешьте больше органической черники

Черника – это не только вкусная ягода, она также удваивает количество натуральных клеток киллеров в организме. Совместное исследование, проведенное Университетом Аппалачии, Университетом Монтаны и Университетом Вандербильта, изучало количество NK-клеток у бегунов, которые употребляли чернику, и тех, кто этого не делал. Исследование обнаружило, что «ежедневное потребление черники в течение 6 недель увеличивает количество NK-клеток». Они также обнаружили, что увеличение количества потребляемой черники в день, снижает окислительный стресс и увеличивает уровни противовоспалительных цитокинов. Цитокины представляют собой белки, секретируемые иммунными клетками, которые влияют на другие клетки в организме.

1. Добавьте специй в свой рацион

Науке давно известно об . Но знаете ли вы, что черный перец и кардамон хорошо воздействуют на иммунную систему и увеличивают производство натуральных клеток киллеров ?

Согласно исследованию 2011 года, опубликованному в журнале Journal of Medicinal Food, в котором основное внимание уделялось этим двум специям, их иммунорегуляторные эффекты были окончательно доказаны . Однако исследователи были удивлены тем эффектом, который эти две специи оказывают на натуральные клетки киллеры.

«Удивительно, но экстракты черного перца и кардамона значительно усиливают цитотоксическую активность натуральных клеток киллеров, указывая на их потенциальные противораковые эффекты », — говорится в отчете. «Наши находки свидетельствуют о том, что черный перец и кардамон оказывают иммуномодулирующее действие и противоопухолевую активность, и поэтому они проявляют себя как природные вещества, которые могут способствовать поддержанию здоровой иммунной системы .»

1. Повысьте уровень бета-каротина, который получает ваш организм

Продукты с высоким содержанием бета-каротина, такие как , капуста кейл, шпинат и стимулируют активность NK-клеток.

Интересное исследование, проведенное почти 20 лет назад и опубликованное в Международном журнале Food Sciences and Nutrition, сравнило эффективность NK-клеток, подверженных воздействую бета-каротина и витамина Е, когда эти NK-клетки взаимодействовали с клетками лимфомы человека и мыши. Исследователи обнаружили, что NK-клетки под воздействием и витамина Е, и бета-каротина проявляют повышенную цитотоксическую активность против клеток рака легких.

1. Ешьте больше чеснока и грибов

1. Принимайте

Витамин С является отличным иммуномодулятором. Согласно отчету, опубликованному в журнале «Иммунофармакология и Иммунотоксикология» , « , способствовал увеличению активности натуральных клеток киллеров почти в 10 раз у 78% пациентов, которые подвергались высокому уровню токсичности ».

1. Повышайте температуру тела

Повышение температуры тела посредством нахождения в инфракрасной сауне, гелиотерапии, принятия лечебных ванн напрямую связано с повышением иммунных функций организма. По словам доктора Набухиро Йошимизу (MD, PhD), при повышении температуры тела на 1%, иммунные функции тела увеличиваются на 40%!

12. Другими способами стимуляции натуральных клеток киллеров является прием эхинацеи и женьшеня обыкновенного.

(с)

Естественными киллерами крови называют большие лимфоциты, содержащие большое количество цитологических ферментов. Эти лимфоциты на поверхности мембраны имеют специальные рецепторы, с помощью которых они узнают инфицированные вирусами, стареющие, поврежденные, опухолевидные и другие клетки представляющие опасность для организма. Связавшись с ними, они с помощью ферментов цитоплазмы инактивируют и уничтожают их.

Имеются 2 основные популяции и 2 специфические субпопуляции NK-клеток.

Основные популяции NK-клеток:

Лизирует инфицированные вирусами, поврежденные и стареющие клетки;

Находятся в печени и матке и убивают любые лимфоциты, которые активируются пищевыми антигенами и антигенами плода, обуславливая их устойчивость к этим чужеродным для организма веществам.

Специфические субпопуляции NK-клеток:

Лимфокинактивированные (ЛАК-клетки) цитотоксичные к опухолевым клеткам, активируют Т-лимфоциты и эозинофилы;

Киллерные клетки (К-клетки) находятся в барьерных органах и слизистых оболочках, лизируют возбудителей туберкулезаи оппортунистических инфекций.

Кроме прямого киллерного эффекта NK-клетки осуществляют связь, между врожденным и приобретенным иммунитетом стимулируя последний, и принимает активное участие в сохранении постоянства гомеостаза организм.

Тимусзависимые лимфоциты (Т-лимфоциты)

Это те лимфоциты, которые прошли подготовку в вилочковой железе (тимусе)

Функция T-лимфоцитов

Т-лимфоциты играют важную роль в трех функциях иммунной системы:

1. В клеточном иммунитете.

2. В регулировании активности В-клеток.

3. В гиперчувствительности замедленного (IV) типа:

По функциональным свойствам делятся на киллеры, хелперы, супрессоры (СД2, СД4, СД8).

Т-лимфоцитами киллерами (СД2) называют цитотоксические Т-лимфоциты, способные разрушать микроорганизмы, клетки организма, содержащие вирусы и бактерии и перерожденные измененные клетки организма. Разрушение клеток-мишеней происходит при прямом контакте с клетками за счет выделения лимфотоксина. Эти клетки очень устойчивы в организме и длительно живущие.

Т-лимфоциты хелперы(СД4) выполняют посредническую, сигнальную функцию, передавая информацию об антигенах Б-лимфоцитам. В гуморальном иммунном ответе они реагируют с гаптеном тимусзависимого антигена, индуцируя превращения Б-лимфоцитов в плазмоциты. В их присутствии синтез антител плазмоцитами увеличивается в 2-3 раза. Также относятся к группе долгоживущих лимфоцитов.

Т-лимфоциты супрессоры(СД8) являются регуляторами антителообразования и других иммунных процессов и участвуют в формировании иммунологической памяти. Длительно живущие клоны лимфоцитов СД2, СД4 и СД8 составляют основу клеточной иммунной памяти. В крови на долю Т-лимфоцитов приходится 50-70 % всех лимфоцитов.

Б - лимфоциты

Б-лимфоциты составляют 15 - 35 % всех лимфоцитов, циркулирующих в крови.

Б-лимфоциты развиваются в костном мозге. Затем Б-лимфоциты распространяются током крови в специфические области периферической лимфоидной ткани. После стимуляции специфическим антигеном Б-лимфоциты трансформируются в плазмациты. Плазматические клетки синтезируют иммуноглобулины (антитела), которые являются специфичными белками для антигена.

Образование циркулирующих антител, специфичных для антигенов - основа приобретенного гуморального иммунитета. Выделяют 5 классов иммуноглобулинов (A, E, G, D, M)

Тромбоциты

Бесцветные круглые пластинки, имеющие двояковыпуклую форму, по величине в 2 - 8 раз меньше эритроцитов. Тромбоциты живут всего 8-12 суток. Они, по сути,- это «служба МЧС» в организме.

Длятого чтобы организм оставался живым, необходимы среди прочих такие два условия, как жидкое состояние крови и целостность, или замкнутость, кровеносного русла. Эти условия обеспечиваются за счет системы свертывания крови . Именно эта система сохраняет циркулирующую кровь в жидком состоянии и восстанавливает целостность сосудистого русла, образуя кровяные сгустки (тромбы) в поврежденных сосудах. Для исследования тромбоцитов обычно делают специальный анализ - коагулограмму, по результатам которого оценивают состояние свертывающей системы крови (гемостаз).

Плазма крови

Плазма крови на 90-92 % состоит из воды, а остальные 8-10 % приходятся на многочисленные растворенные в ней вещества. В основном это белки - 7-8 %: альбумины (около 4,5 %), глобулины (2 - 3 %) и фибриноген.

Другие азотистые вещества в плазме:

а) Аминокислоты и «обрывки» белков пищи, которые всасываются в пищеварительном тракте и используются клетками организма для синтеза собственных белков;

б) Продукты распада собственных белков и нуклеиновых кислот - мочевина, креатин, креатинин, мочевая кислота, которые должны быть выведены из организма. Мочевина составляет примерно половину всего количества небелкового азота в плазме крови (остаточного азота).

В плазме присутствуют также органические вещества, не содержащие азота, - глюкоза, нейтральные жиры и липиды. Около 0,9 % всех веществ, содержащихся в плазме, являются солями натрия, калия и кальция.

В плазме крови содержатся гормоны, ферменты, антигены, антитела и вообще все, что должно быть доставлено из одного места организма в другое.

Концентрация любого из этих веществ определяется при биохимических исследованиях крови, и этих анализов существует столько, сколько веществ циркулирует в крови.

Обычно биохимические анализы назначаются при подозрении на конкретное заболевание с целью определить содержание или установить сам факт наличия конкретного вещества.

Министерство здравоохранения Республики Беларусь Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет

на тему: «Система естественных киллерных клеток»

Подготовил: студент 2 курса 29 группы

лечебного факультета

Рыбчинский Михаил Андреевич

Проверил: Шилин Владимир Евгеньевич

Витебск,2014

Введение

Натуральные киллеры (NK-клетки)

Цитотоксическое действие NK-клеток на клетки-мишени

Перфорин

ФАТ: действе на натуральные киллеры

Новый тип иммунных клеток, способных уничтожать опухоли

Рецепторы, с помощью которых NK-клетки детектируют клетки-мишени

NKT-лимфоциты

Литература

Натуральные киллеры (nk-клетки)

NK-клетки – это большие гранулярные лимфоциты, принадлежащие к системе врожденного иммунитета. Они не относятся ни к Т-, ни к В-лимфоцитам, поэтому их еще называют нулевыми лимфоцитами. NK-клетки образуются в костном мозге из общих предшественников с Т-лимфоцитами под влиянием ИЛ-15. На поверхности NK-клеткок имеется маркерный дифференцировочный антиген CD56. Субпопуляция NK-клеткок с фенотипом CD56+16+, имеющих поверхностный Fc-рецептор к IgG, участвует в осуществлении антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦТ). Среди мембранных молекул, экспрессируемых NK-клетками, находятся молекулы CD2 (характерные для Т-лимфоцитов), а также β-цепь рецептора для ИЛ-2, однако они не экспрессируют ТКР и белок CD3. На NK-клетках отсутствуют и иммуноглобулиновые рецепторы В-лимфоцитов, а также характерные CD-маркеры этих клеток .

Таким образом, для большинства NK-клеток характерен фенотип: CD56+16+ CD2+ CD3-. Существует две субпопуляции NK-клеток: с высоким уровнем экспрессии CD56 и с низким уровнем экспрессии CD56. Первая субпопуляция в большей степени специализирована на осуществлении цитотоксической функции, а вторая – на продукции цитокинов.

NK-клетки оказывают неспецифическое цитотоксическое действие на широкий спектр опухолевых клеток и на клетки, инфицированные многими вирусами и некоторыми внутриклеточными патогенами. В периферической крови содержание NK-клеток составляет от 5 до 10% от всех лимфоцитов периферической крови .

NK-клетки не проходят дифференцировку в тимусе, они выходят из костного мозга в кровь и затем мигрируют в ткани, где осуществляют врожденную иммунную защиту, называемую естественной цитотоксичностью, которая особенно важна для защиты организма от вирусов и опухолей.

Во время инфекции или опухолевого роста NK-клетки привлекаются в очаг патологии и активируются цитокинами и хемокинами, секретируемыми другими клетками врожденного иммунитета, в первую очередь гранулоцитами, или вирус-инфицированными клетками других тканей в очаге инфекции. Особенно важную роль в этом играют интерфероны I типа (IFN-α IFN-β), ИЛ-15 и ИЛ-12. IFN-ы I типа, которые продуцируются клетками многих типов в ответ на инфицирование вирусами, являются сильными активаторами NK-клеток, включая клеточно-опосредованную неспецифическую цитотоксичность и продукцию ими цитокинов.

ИЛ-15 совместно с ИЛ-12 (который продуцируют активированные дендритные клетки и макрофаги) индуцируют секрецию NK-клетками значительных количеств IFN-γ. Другие цитокины, продуцируемые в очаге инфекции макрофагами и эпителиальными стромальными клетками, такие как ИЛ-1,6,18, TNF-α и др., усиливают осуществляемый NK-клетками ответ .

В свою очередь, IFN-γ, секретируемый NK-клетками, активирует макрофаги, стимулируя их фагоцитарную и микробицидную активность и повышая продукцию провоспалительных цитокинов, и оказывает противовирусное действие в очаге инфекции. После привлечения с помощью хемокинов и воспалительных цитокинов NK-клеток в лимфоузлы выделяемый ими IFN-γ способствует дифференцировке наивных Т-клеток в сторону образования Тх1, одновременно подавляя образование Тх2 и их функции. Таким образом, продуцируя ряд иммунологически важных цитокинов, NK-клетки играют важную роль в иммунной регуляции, влияя как на врожденный, так и на адаптивный иммунный ответ.

Активированные NK-клетки синтезируют также TNF-α (индуцирующий апоптоз клеток-мишеней), ИЛ-24 (аутокринно индуцирующий синтез TNF-α и IFN-γ), ИЛ-32 (член семейства ИЛ-1, провоспалительный цитокин и индуктор синтеза TNF-α), а также ИЛ-13 и ИЛ-26 (член семейства ИЛ-10), которые являются противовоспалительными цитокинами, подавляют Тх1-ответ и стимулируют синтез IgE .

Аннотация

NK-клетки характеризуются как не В-клетки и не Т-клетки, лишённые характеристик зрелых макрофагов, которые развиваются из клеток костного мозга независимо от влияния тимуса. NK-клетки играют решающую роль в гибели опухоли, иммунологическом надзоре, сопротивляемости инфекциям и иммунном регулировании процессов организма. Разрушение нормальными киллерами раковых клеток включает в себя определенную последовательность событий. Во-первых, клетка NK распознает раковую клетку и привязывается к ней. Этот процесс требует межрецепторного взаимодействия. NK-клетка выделяет гранулы, которые проникают в раковую клетку и в конечном итоге убивают ее. После чего NK-клетка освобождается для привязки к другой раковой клетке и процесс повторяется.

Однако раковые клетки знают, как вести своего рода клеточную войну. Мы впервые в нашей лаборатории открыли, что раковые клетки могут уничтожать лейкоциты посредством фагоцитоза. Мы наблюдали три способа, которыми это делается. Раковая клетка может окружить с двух сторон лейкоциты или может создать чашеобразное отверстие, внутрь которого затягиваются лейкоциты. Третий способ заключается в том, что раковая клетка вытягивает длинное плечо, чтобы захватить лейкоцит и, в конце концов, затянуть его внутрь раковой клетки, где он переварится. Кроме того, другие работы показали, что раковые клетки выделяют иммуносупресивные вещества, которые ослабляют функцию иммунной системы.

За последние 25 лет были сделаны многочисленные попытки укрепления иммунной системы с помощью различных модификаторов биологической реакции (МБР). Эти вещества, создаются из бактерий и грибков, которые обладают иммунорегуляторными свойствами. Кроме того, некоторые виды цитокинов работают подобно МБР, например, интерфероны, интерлейкин-2 и интерлейкин-12. Есть две проблемы, связанные с этими МБР: 1) токсичность, 2) развитие низкой реактивности, при которой однократное введение МБР может значительно повысить активность клеток NK, но повторное введение того же МБР приведет к депрессии активности NK-клеток. Интересно отметить, что BioBran имеет преимущества перед другими МБР. Он нетоксичен и не показал низкой реактивности за четыре года наблюдений. Настоящая работа была проведена с целью изучения влияния нового МБР, известного под названием BioBran, на функцию NK-клетки и пролиферацию Т-и В-клеток у 32 пациентов. У отдельных пациентов были зарегистрированы опухолевые антигены.

Пациенты

Настоящее исследование проводилось на 32 пациентах страдающих от раковых заболеваний. У пациентов были различные типы опухоли: простаты, молочной железы, множественная миелома и лейкемия. Большинство пациентов прошли через циторедукцию при помощи традиционных видов терапии, таких как хирургическое вмешательство, лучевая терапия или химиотерапия.

Материалы

BioBran – это арабиноксилан, полученный из экстракта рисовых отрубей, обработанный под воздействием ферментов из грибов шиитаке. Это полисахарид, который содержит гемицеллюлозу. Торговое название BioBraп – BioBran MGN-3 (компания Daiwa Pharmaceuticals, Co., Ltd., Токио, Япония).

Методы

Протокол лечения. Пациентами давали BioBran (3 г в день) ежедневно перорально.

Опухолевый специфический антиген (ОСА). ОСА для каждого типа опухоли измерялся до начала лечения препаратом BioBran и через месяц после лечения.

Линия опухолевых клеток. К562, клетки эритролейкемической линии человека, использовались в качестве целевой. Опухолевые клетки культивировались в полной среде, состоящей из RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% антибиотика (100 единиц пенициллина и 100 г\мл стрептомицина).

Препарат лимфоцитов периферической крови (ЛПК). ЛПК были приготовлены из свежей гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Hypaque. Клетки были два раза промыты сбалансированным солевым раствором Хенкса и ресуспендированы до концентрации 10 х 106 кл\мл в общей среде.

51CR – анализ для измерения активности NK-клеток. Активность нормальных киллеров измерялась стандартным 4-х часовым 51CR- анализом. Вкратце, 1х104 опухолевые целевые клетки, меченные Cr в 0.1 мл обшей среды добавлялись в различные лунки 96-луночного титрационного планшета. Затем клетки-эффекторы пипеткой переносились в ячейки в 4 копиях, чтобы получить соотношение клеток-эффекторов к целевым клеткам (E:T) 12:1, 25:1, 50:1 и 100:1. После 4 часового инкубационного периода при температуре37 °C, планшеты были центрифугированы (1 400 об\мин в течение 5 минут) и было собрано 0.1 мл центрифугата из каждой лунки и пересчитано по гамма-счетчику (Beckmann G50, Beckmann Instruments).

Процент освобождённых изотопов рассчитывался по следующей формуле:

Спонтанное освобождение из целевых клеток составило не боле 8-10% от общего освобождения. Общее освобождение измерялось прибавлением 0.1мл Тритона Х-100 (Sigma Chemical Co.) в назначенные лунки. Единицы лизиса рассчитывались из кривых титрования эффектора с одной определённой единицей лизиса, так как требовалось, чтобы количество клеток-эффекторов достигло 20% лизиса для К562.

Гранулярность естественных киллеров. Выделение лимфоцитов периферической крови в градиенте перколла было настроено на 2.5=10.6\мл и центрифугировано на слайдах при 1 000 об\мин в течение 5 минут при помощи цитоцентрифуги (Shanton Southern Institute, Сеуикли, Пенсильвания). Слайды были высушены в воздушной сушке, фиксированы метанолом, окрашены 5% раствором Гимзе в течение 10 минут. Окрашенные препараты были изучены на предмет гранулярности NK-клеток.

В естественных условиях пролиферация T-лимфоцитов и В-лимфоцитов. Мы исследовали влияние в естественных условиях BioBran на пролиферацию Т-клеток и В-клеток при помощи тимидина. Мононуклеарные клетки были подготовлены из периферической крови пяти раковых пациентов до лечения BioBran и через месяц после лечения. Клетки были инкубированы при 2х105 кл\мл в общей среде. Клетки были обработаны фитогемагглютинином (10г\мл), конканавалином А или митогеном лаконоса в течение 3 дней. На последние 18 часов к культурам клетки был добавлен меченый тритием тимидин. Были собраны образцы ДНК и определено накопления тимидина при помощи сцинтиллоскопа. Все эксперименты проводились в трех повторениях, данные выражены, как число импульсов в минуту.

Статистический анализ. Т-критерий Стьюдента применялся для изучения значимости отклонений между активностью NK-клеток и реакцией Т- и В-клеток на митогены до и после лечения препаратом BioBran.

Результаты

1. Активность NK -клеток

Рисунок 1 показывает базовые значения цитотоксичных ответов NK-клеток у 32 пациентов, больных раком. У пациентов отмечался общий низкий уровень функции NK-клеток. Депрессия активности NK-клеток наблюдалась у пациентов с разными типами опухолей: простаты, 11.1 единиц лизиса; молочной железы 11.4 единиц лизиса; множественная миелома, 7.3 единиц лизиса; лейкемия 4.3 единиц лизиса. Исследования лимфоцитов периферической крови у 12 участников спустя 1-2 недели после первичного исследования, не выявили статистически значимых различий в активности NK-клеток по сравнению с первоначальными результатами. Лечение MGN-3 показало значительное повышение активности NK-клеток до десяти раз. Усиливающий эффект MGN-3 был выявлен при всех типах опухолей: простаты 41.9 единиц лизиса; молочная железа 33 единиц лизиса; множественная миелома 31.9 единиц лизиса; лейкемия 51.4 единиц лизиса.

Рисунок 1. Влияние BioBran на активность NK-клеток у 32 пациентов от одной до двух недель после лечения. Типы опухолей: простата (10), молочная железа (12), множественная миелома (5), лейкемия (5). Единицы лизиса при 20% *р < 0.001

2. Гранулярность NK -клеток.

Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови до лечения показала низкую гранулярность или ее отсутствие (рис.2а).

Рисунок 2(а) . Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови. NK-клетки были взяты от ракового пациента до начала лечения BioBran. Обратите внимание на ядерно-плазменное отношение и отсутствие гранул.

Рисунок 2(b ). Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови того же пациента через 1 неделю после лечения BioBran. Клетки демонстрируют высокое гранулярное содержание.

С другой стороны, лечение BioBran показало значительное повышение гранулярного содержания через 1 неделю после лечения (рис. 2b). Активированные BioBran NK-клетки показали повышение связывающей способности и способности уничтожать раковые клетки (рис. 3).

Рисунок 3. Препарат цитоцентрифугирования опухолевой клетки К562. NK-клетки были активированы BioBran. (а) Первый шаг процесса представлен связыванием NK-клетки к клеткой опухоли. (b) Одна опухолевая клетка мертва. (с) Обе опухолевые клетки мертвы, а NK-клетка все еще активна. (d) NK-клетка самостоятельно отделяется от мертвых опухолевых клеток.

3. Пролиферация в естественных условиях Т- и В-лимфоцитов

Рисунок 4 показывает, что лечение BioBran значительно повысило пролиферацию Т-клеткок, это показывает реакция на митогены: фитогемагглютинин и конканавалин А. Пролиферация В-клеток также повысилась после лечения BioBran, о чем свидетельствует реакция на митоген лаконоса, по сравнению с базовым значением.

PHA – фитогемагглютинин, Con A - конканавалин А, PWM - митоген лаконоса

Рисунок 4. Действие BioBran в ответ на митоген. Т- и В-клетки через месяц после лечения. Мононуклеарные клетки были культивированы из периферической крови в присутствии фитогемагглютинина, конканавалина А и митогена лаконоса. Данные представляют среднее значение (стандартное отклонение у пяти человек.) *р<0.001.

4. ОСА и активность естественных киллеров у отдельных пациентов

Пациентов проверили на предмет опухолевого специфического антигена: простата, простат специфический антиген (ПСА); множественная миелома, белок Бен-Джонса (ББД) или ICg. Рак молочной железы проверялся при помощи РЭА и КТ сканирования от одного до двух раз в год. Был проведен анализ различных типов злокачественных опухолей у отдельных пациентов.

Пациент К, 39 лет. Был поставлен диагноз острый миелогенный лейкоз. Была проведена химиотерапия, в результате которой число лейкоцитов составило 5.6, при норме от 4.5 до 10.5. Химиотерапия была прекращена и пациент начал принимать BioBran в январе 1995 года. Показатели лейкоцитов оставались в норме с того времени. Активность NK-клеток пациента составила 7.9 единиц лизиса и повысилась до 113 единиц лизиса через одну неделю после лечения BioBran. Уровень активности NK-клеток остается высоким уже в течение 4 лет.

Пациент Y, 52 года, менеджер магазина из Японии. Ему также был поставлен диагноз острый миелогенный лейкоз. Он отказался от традиционного лечение. Количество лейкоцитов 31 марта 1998 года составило 18 700\мл. Пациент начал принимать BioBran.и 30 апреля число лейкоцитов упало до 11 000. С того времени его состояние остается стабильным.

В 1994 году R обратился к нам по поводу рака простаты. Гормональная терапия привела к тому, что уровень ПСА был 0.1, но известно, что маркёр со временем снова повышается. Пациенту начали давать BioBran.и уровень ПСА остается в норме последние 4 года.

М, пациентка, у которой возник рецидив рака молочной железы в апреле 1995 года. До этого ей была проведена операция, за которой последовала химиотерапия. Она начала прием BioBran после завершения курса химиотерапии и с тех пор компьютерная томография показывала хорошие результаты. Больше не было признаков рецидива заболевания, согласно компьютерной томографии и биопсии. Активность NK-клеток пациентки составила 16.4 единицы лизиса. Это увеличенные в два раза показатели после одной недели лечения BioBran. Активность продолжала увеличиваться до 128 единиц лизиса и остается на высоком уровне в последние годы.

Обсуждение

BioBran считается сильным модификатором биологического ответа, о чем свидетельствует повышенная активность NK-клеток у животных и человека. Интраперитонеальная инъекция мышам BioBran показала повышение активности NK-клеток в несколько раз через два дня после лечения. Другие исследования на крысах, в которых BioBran применялся вместе с пищей, также показал повышение активности NK-клеток в зависимости от применяемой дозы. Исследования проводились и на здоровых участниках, которые принимали BioBran перорально. Повышение активности NK-клеток в 2-3 раза наблюдалось через неделю после лечения BioBran в дозе 30 и 45 мг\кг в день, а более низкие дозы 15 мг\кг в день показали повышение активности в два раза только через месяц.

По нашему мнению, особенный интерес представляет исследование стимулирующего влияния BioBran на активность NK-клеток у пациентов с наличием злокачественного новообразования. Пациенты прошли химиотерапию и лучевую терапию, так как требовалась циторедукция. Однако в результате этих воздействий активность естественных киллеров снижалась. Учитывая потребность организма в естественном иммунитете, мы поняли, что усиление активности NK-клеток может оказаться клинически крайне важным для уничтожения оставшихся раковых клеткок, которые не были уничтожены во время лучевой и химиотерапии. Возможно усилить активность NK-клеток за счет применения различных модификаторов биологического отклика. Однако токсичность и низкий иммунологический ответ ограничивают их применение. BioBran является безопасным продуктом, у пациентов не развивалась устойчивость к иммуному ответу на препарат во время 4 лет проведения исследования. За активностью NK-клеток велось наблюдение, чтобы можно было задокументировать все изменения в активности циркулирующих иммуноцитов во время терапии с данными препаратами. Было выявлено усиление активности NK-клеток благодаря BioBran уже через 1-2 недели после лечения, и эта активность удерживалась на высоком уровне при продолжении лечения BioBran.

Циторедукция, за которой следовала иммунотерапия BioBran применялась к 32 пациентам, больным раком. Кроме повышения активности NK-клеток, пациенты показали постепенное снижение уровня опухоль специфического онтигена без признаков увеличения в течение 4 лет, пока проводилось исследование.

Изучались механизмы, благодаря которым BioBran повышает активность NK-клеток. Согласно нашим исследованиям, два механизма отвечают за активность NK-клеток, вызванную BioBran. Во-первых, это происходит за счет гранулярности NK-клеток, во-вторых – за счет повышения производства цитокина. Что касается гранулярности, NK- клетки наших пациентов имели либо низкую гранулярность, либо ее полное отсутствие. Примечательно, что лечение BioBran значительно повышало гранулярное содержание NK-клеток (Рис. 2). Гранулы располагаются не только в порции цитоплазмы, но также и между ядерными и клеточными мембранами. Экзоцитоз гранул NK-клеток и секреция молекул, формирующих поры (перфорины), хранящиеся как цитоплазмические гранулы могут представлять один из важнейших механизмов для уничтожения клеток рака системой NK-клеток. Важная роль гранул при уничтожении опухолевых клеток NK-клетками была выявлена при наблюдении за изолированными и очищенными гранулами. Они обладают разлагающим воздействием на разные типы опухолевых клеток. Следовательно, мы полагаем, что повышенный уровень гранулярности NK-клеток является важным фактором для усиления клеточного ответа на гибель рака благодаря применению BioBran.

Что касается цитокинов, было выявлено, что сразу несколько цитокинов влияют на пролиферацию NK-клеток или на цитолитическую активность. Большему изучению подверглись интерфероны и ИЛ-2. Подавление активности NK-клеток у раковых пациентов была связана с недостаточным производством лимфокина. Предположительно, усиление цитотоксической функции NK-клеток за счет введения BioBran совпадает со значительным повышением уровней различных цитокинов. Грануляция больших гранулярных лимфоцитов может указывать на секреторную функцию. Пока не известно является ли производство различных лимфокинов полифункциональным свойством подгруппы больших зернистых лимфоцитов. Более вероятно, что различные подгруппы больших зернистых лимфоцитов ответственны за различные лимфокины. В лабораторных исследованиях было выявлено, что лечение BioBran значительно повышает производство ФНО-альфа и интерферонов. Кроме того, пациенты с различными типами злокачественных опухолей показали повышение уровней ИЛ-2, ИЛ-12, ФНО-альфа после лечения BioBran.

Наша работа показала первичный эффект BioBran на NK-клетки. Однако есть данные, полученные от здоровых контрольных участников исследования, что другие иммуноциты, Т- и В-клетки показали усиление своих функций после лечения. В данном исследовании мы выявили, что у пациентов были усилены функции Т- и В-клеток, как доказательство реакции пролиферации на разные митогены. Это доказывает, что BioBran вызывает общую стимуляцию иммунитета.

Предварительные результаты настоящего исследования достаточны для проведения дальнейших клинических исследований.